Freie Vortragssitzungen, Samstag, 3.10.2015

 
Saal 3 08:00 - 09:30 03.10.2015
Freie Vortragssitzung Sa05
Retina: Grundlagen Retina: Basics
Vorsitzende/r: Hansjürgen Agostini (Freiburg), Alexa Klettner (Kiel)

Referent/in: Elisabeth Richert (Kiel)
Fragestellung: Die Nanopuls-SRT-Behandlung zerstört selektiv retinales Pigmentepithel (RPE) unter Erhalt der Neuroretina. Sie stimuliert die RPE-Regeneration, welche verschiedene Netzhauterkrankungen positiv beeinflussen kann. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung folgender AMD-relevanter Mediatoren nach SRT: Matrixmetalloproteasen (MMPs), Pigment Epithelium Derived Factor (PEDF), Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) sowie der Proliferationsmarkers Ki67 und Vergleich der Zellantwort nach Behandlung mit unterschiedlichen Läsionsgrößen. Methodik: Porcine Explantate (RPE, Bruch´sche Membran [BrM], Choroidea) wurden mit einem gepulsten 532 nm Nd:YLF Laser (Pulsdauer 250 ns, Repetitionsrate 100 Hz, Spotgrößen 100/200 µm) knapp überschwellig behandelt, sodass die Mehrzahl der Zellen im Behandlungsareal zerstört wurden. Die Kultivierung in modifizierten Ussingkammern erlaubte eine Differenzierung zwischen apikaler und basaler Proteinsekretion. Analysen zur Überlebensschwelle und Morphologie der RPE-Zellen wurden mittels Calceintest durchgeführt. Die MMP-Sekretion wurde via Zymographie und die VEGF- bzw. PEDF-Sekretion mittels ELISA untersucht. Die Expression von MMP2 und Ki67 wurde in der Immunfluoreszenz untersucht. Die statistische Analyse erfolgte mittels t-Test. Ergebnisse: Die RPE-Läsionen wurden von einer verminderten Anzahl vergrößerter Zellen geschlossen, die z.T. einen zweiten Zellkern und ein positives Signal für die Expression von MMP2 und Ki67 in der Immunfluoreszenz zeigten. Nach SRT mit 200 µm Spots zeigte sich nach 4 Tagen ein signifikanter Anstieg des aktiven MMP2 auf das 1,74-fache (±0,85) und des PEDF-Gehalts auf 125% (±32,2), bei gleichzeitiger signifikanter Abnahme des VEGF-Gehalts auf 88% (±19,2) im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Die beschriebenen Effekte zeigten sich nicht bei der Behandlung mit 100 µm Spots. Zusammenfassung: Die SRT stellt eine Behandlungsmöglichkeit zu Prävention früher degenerativer Veränderungen der AMD dar. Sie erhöht die basolaterale Sekretion von MMP2, welches den Stofftransport durch die BrM erleichtern kann. Im Rahmen der Wundheilung zeigte sich eine erhöhte PEDF-Sekretion bei gleichzeitiger VEGF-Reduktion. Für die Beeinflussbarkeit der genannten Zellmediatoren war eine Spotgröße von mindestens 200 µm nötig, denn bei kleineren Läsionen zeigte sich kein Effekt nach SRT, wobei kumulativ die gleiche Fläche behandelt wurde.
Referent/in: Mahdy Ranjbar (Lübeck)
Zielsetzung: Die Oraya-Therapie (OT) ist eine Behandlungsoption für Patienten mit neovaskulärer AMD. Die 2-Jahres-Ergebnisse der INTREPID-Studie (n=230) zeigen bei gleichbleibendem Visus eine signifikant reduzierte Anzahl notwendiger intravitrealer Medikamenteneingaben. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt wird die OT durch die vier Universitätskliniken Lübeck, Essen, Köln und Freiburg angeboten. Die Universitätsklinik Lübeck erhielt im Februar 2014 die Bevollmächtigung für den Betrieb der Strahlenanlage (IRay-System 5000, Oraya Therapeutics) und begann im selben Monat mit der Patientenbehandlung. Die vorliegende Arbeit soll die Ergebnisse der ersten Behandlungen auf der Basis von Fallberichtsdarstellungen zeigen. Methode: Ausgewählte Fallberichte zur OT bei neovaskulärer AMD und bestehender anti-VEGF-Therapie werden gezeigt, insbesondere um auf den Selektionsprozess von behandelbaren Patienten einzugehen und Erfahrungen in Bezug auf die Wirksamkeit und Sicherheit über einen Zeitraum von 12 Monaten zu berichten. Ergebnis: Die OT ist eine Behandlungsoption für Patienten mit neovaskulärer AMD, die auf die anti-VEGF-Therapie nicht oder nach Meinung des behandelnden Augenarztes nur unzureichend ansprechen. Die im kurzen Beobachtungszeitraum mit der OT gemachten Erfahrungen sind positiv in Bezug auf Wirksamkeit und Sicherheit zu bewerten. Schlussfolgerung: Die Fragestellung, ob die OT eine Behandlungsoption ausschließlich für Non-Responder und Patienten mit inadäquater Response ist, lässt sich nur auf der Grundlage von Langzeitdaten beantworten. Dies ist sehr bedeutsam vor dem Hintergrund, dass Patienten die OT als Option betrachten, die Belastung der anti-VEGF-Therapie, die durch die hohe Anzahl an Untersuchungen und Injektionen einhergeht, zu reduzieren. Langzeitdaten zur Wirksamkeit und Sicherheit der OT aus dem implementierten Radiotherapieregister der neovaskulären AMD sowie Ergebnisse aus weiteren klinischen Studien zur OT werden in Zukunft dazu beitragen, die Patientengruppe mit neovaskulärer AMD zu identifizieren, die bestmöglich von der OT profitiert.
Referent/in: Katharina Kern (Lübeck)
Fragestellung: Subletale Hyperthermie wird derzeit als eine Strategie zur Verbesserung der Zellfunktionalität des retinalen Pigmentepithels (RPE) untersucht. Ziel dieser Arbeit ist es, die Wirkung subletaler Hyperthermie auf die Expression und Sekretion unterschiedlicher Proteine in RPE-Zellen zu überprüfen. Methode: Primäre porcine RPE-Zellkulturen dienten als Modell. Zur thermischen Stimulation wurden die Zellkulturen in der P2-Generation in einer 30 mm Kulturschale mittels Thuliumlaser (λ= 1940 nm) bestrahlt (Spotdurchmesser= 30 mm). Im zentralen Bereich der Zellkulturschale lag hier die maximal erreichbare Temperatur Tmax an. Die Temperaturverteilung verlief annähernd gaußförmig, wobei die niedrigste Temperatur in den Randbereichen der Schalen auftrat. Durch unterschiedlich eingestellte Leistungen wurden Tmax- Temperaturen von 40, 43, 46, 50 und 58 °C gewählt. Die sekretierten Mengen an VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) und PEDF (Pigment Epithelium-Derived Factor) wurden 3, 24 und 48 Stunden nach der Bestrahlung mittels ELISA bestimmt. Die intrazelluläre Menge der Proteine von HSP (Heat Shock Protein) 70, VEGF und PEDF wurde über Western Blot analysiert. Ergebnisse: Die Schwellenwert-Temperaturen für den Zelltod nach 3 und 24 Stunden konnten durch Zell-Vitalitätstests bestimmt werden. Tmax-Temperaturen ≤ 46 °C wurden als subletal und Temperaturen ≥ 50 °C als letal angenommen. Die Sekretion von VEGF erhöhte sich temperaturabhängig. Signifikante Steigerungen (um 20 %) traten bei der Bestrahlung auf Tmax ≥ 50 °C auf, wohingegen die intrazellulären Proteinmengen von VEGF nach der Bestrahlung auf Tmax ≥ 43 °C signifikant abfielen. Diese Abnahme verhielt sich temperatur- und zeitabhängig. Die Sekretion sowie die intrazellulären Proteinmengen von PEDF zeigten keine Temperaturabhängigkeit. Intrazelluläre Mengen an HSP70 stiegen nach der Bestrahlung auf letale Temperaturen (Tmax≥ 50 °C) drastisch um bis zu 500 % an, wohingegen subletale Temperaturen (Tmax≤ 46 °C) zu einem moderaten Anstieg der intrazellulären HSP70-Konzentration um 200 % führten. Schlussfolgerungen: Die Ergebnisse lassen die Vermutung zu, dass sich eine subletale Hyperthermie signifikant auf die Proteostase von RPE-Zellen auswirken könnte. Der nach der Laserbestrahlung auftretende temperaturabhängige Anstieg von intrazellulärem HSP70 und das Abfallen der intrazellulären VEGF-Konzentration könnte auf einen antioxidativen sowie antiangiogenetischen Effekt hindeuten.
Referent/in: Diana Pauly (Regensburg)
Study objectives: Millions of individuals older than 50-years suffer from retinal degeneration. Recent studies suggest an important role of the complement system in these disease progressions. However, the underlying mechanisms by which complement proteins contribute to degeneration remain unclear. A spectrum of retinal degeneration is modeled in animals using oxidative stress conditions or genetic modified animals. There is uncertainty about whether the complement system is a local or systemic player involved in this pathogenesis. The goal of this study was a systematic overview to estimate the role of complement involvement in mouse models for retinal degeneration. Methods: We used three different mouse models for the analysis of complement involvement in retinal degeneration: albino ABCA4-/- mice, acute and chronic light-induced retinal damage model. Complement activation was analyzed either in the retina or in the complex of retinal pigmented epithelium (RPE) and choroid on transcriptional (qPCR) and translational level (Western Blot, immunofluorescence staining). We compared samples of mouse disease models with control mice. Results: Transcription of complement proteins was detected in both the retina and RPE-choroid complex independent from analyzed mouse model. We determined distinctive difference in mRNA-expression in the retina between treated and non-treated animals. Light-damaged animals showed a higher expression of C1s, CFB, C4 and C3. This effect was not measurable in Western Blots. Immune detection of CFB, C3 and C9 was only possible in the RPE-choroid tissue and no difference in the animal groups have been analyzed. C4-, C1s- and MASP1-proteins can be determined in both tissues. However, a significant difference was not verified in Western Blots. Conclusions: This comprehensive study revealed detailed information for relevant complement proteins in the healthy and damaged mouse eye. The detection of increased complement transcription in the retina implied a local complement activation in the eye. These essential data for mouse model interpretation will be used for future preclinical tests of therapeutic strategies for degenerative retinal diseases.
Referent/in: Thomas Ach (Würzburg)
Hintergrund: Multinukleäre Zellen sind für verschiedene Organe und Zelltypen des Menschen beschrieben. Für das retinale Pigmentepithel (RPE) werden 3% binukleäre Zellen, basierend auf einer einzigen Studie (PMID 4963693), berichtet. Deren Bedeutung ist allerdings unbekannt. Ziel war es, die Häufigkeit und räumliche Verteilung multinukleärer Zellen innerhalb der Makula an RPE flatmounts zu bestimmen. Methoden: Von neunzehn RPE flatmounts der Makula (PMID 25034602; 9< 51Jahre, 10>80 Jahre, keine Retinopathien) wurden an 12 vordefinierten Stellen mikroskopische Aufnahmen angefertigt (drei Entfernungen zur Foveola: Fovea, Perifovea, Peripherie); vier Quadranten (superior, inferior, temporal, nasal). An jeder Position wurde mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop (Anregungen 488 nm (Lipofuszin-Autofluoreszenz (AF)) und Phalloidin-647 nm (F-actin-Zytoskeleton) Aufnahmen in z-Richtung angefertigt. Zellkerne zeigen sich hierbei als nicht-fluoreszierend und können leicht abgegrenzt und innerhalb von Zellgrenzen (dargestellt als Voronoi Regionen) markiert werden (anwenderspezifische FIJI plugins). Die statistische Analyse erfolgte mit Hilfe von Poisson-Regressionsmodellen. Ergebnisse: Von 196 Aufnahmeorten wurden mehr als 11000 RPE-Zellen ausgewertet: 94.66 % hatten einen Zellkern, 5.31% zwei, 0.02% drei, und 0.01% fünf Zellkerne. Das Alter hatte keinen Einfluss auf die Anzahl der Zellkerne. Signifikante Unterschiede zeigten sich jedoch in der regionalen Verteilung multinukleärer Zellen. Die höchsten Frequenzen multinukleärer Zellen finden sich in der Perifovea (9.9 %) und Peripherie (6.8 %). Die Fovea hingegen weist nahezu keine multinukleären Zellen auf. In allen drei Exzentrizitäten (Fovea, Perifovea und Peripherie) sind im nasalen Quadranten multinukleäre Zellen am häufigsten zu beobachten (Perifovea: bis zu 16.5 %). Schlussfolgerung: Dies ist die erste Studie, die multinukleäre Zellen in der Makula charakterisiert. Multinukleäre Zellen könnten die Folge von Zellfusion oder inkompletter Zellteilung sein. Dass nahezu keine multinukleären Zellen in der Fovea zu finden sind, könnte ein Hinweis auf die speziellen Bedürfnisse von fovealen Zapfen sein. Die Perifovea fällt v.a. durch eine hohe Stäbchendichte und hohe AF-Signale auf. Im nasalen Quadranten könnten u.a. der papillomakuläre Bereich (spezifischer Bedarf des retinalen Metabolismus?) und die optische Schlussleiste (post-embryologische Entwicklungen?) eine Rolle spielen, was es in Folgestudien zu klären gibt.
Referent/in: Sebastian Haen (Tübingen)
Die Graft versus Host Erkrankung (GvHD) ist die wichtigste Komplikation der allogenen Stammzelltransplantation (HSZT). Manifestationsorgane sind Darm, Haut und Leber, aber auch das Zentralnervensystem. Bislang wurde angenommen, dass Donor-T-Zellen Unterschiede in HLA-Molekülen oder exprimierten Peptiden, die als minor Histokompatibilitätsantigene (miHAG) fungieren, zwischen Spender und Empfänger erkennen. In dieser Studie wurden die klinische Manifestation einer GvHD am Augenhintergrund untersucht und die Antigenspezififität allogener T-Zellen gegen Epitope aus Zapfen-Proteinen charakterisiert. Die erste Patientengruppe umfasste 6 Patienten mit Erkrankungen des hinteren Augenabschnitts nach allogener HSZT, die zweite 22 asymptomatische Patienten. Autologe mononukleäre Zellen (PBMC) wurden aus Blutproben vor HSZT isoliert. Als autologe DNS-Kontrollen dienten somatische Zellen aus Mundschleimhaut. Allogene Immunzellen und DNS wurden nach HSZT gewonnen. DNS-Sequenzierung wurde zur Identifikation von Einzelnukleotidpolymorphismen (SNP), Enzyme-linked ImmunoSpot (ELISpot) und intrazelluläre Zytokinfärbungen zur Detektion von T-Zellen durchgeführt. Die ophthalmologischen Diagnosen waren Opticusatrophie (n=2), in einem Fall kombiniert mit selektiver Zapfendegeneration, Opticusneuritis (n=2), anämische Retinopathie (n=1) und VZV-Retinitis (n=1). Insgesamt wurden 55 retina-spezifische HLA-Liganden aus den Proteinen retinale Guanylatcyclase 2D (GUCY2D), retinoid binding protein (RBP) und der Guanylatcyclase aktivierenden Proteine A1 und B1 (GUCA1A/GUCA1B) auf Basis der Gensequenzierungen und bereits bekannter SNP mittels reverser Immunologie [MZ1] [SH2] vorhergesagt. Bei zwei Patienten der Gruppe 1 (bei denen mit selektiver Zapfendegeneration und VZV-Retinitis) konnten autoantigen-spezifische T-Zellen gegen GUCY2D Epitope, bei 6/22 Patienten der Gruppe 2 sequenzspezifische autoantigen-spezifische T-Zellen gegen Epitope aus GUCA1A (n=3), GUCA1B (n=3) und GUCY2D (n=3) nachgewiesen werden. DNS-Sequenzierungen zeigten jeweils keinen relevanten SNP zwischen Spendern und Empfängern. Manifestationen einer GvHD der Retina können durch Virusinfektionen getriggert und sollten daher im Falle atypischer Untersuchungsbefunde für Therapieentscheidungen in Erwägung gezogen und interdisziplinär behandelt werden. Neben Unterschieden in HLA und miHAG können auch Autoantigene erkannt werden. Diese Erkennung stellt einen neuen Pathomechanismus der Graft-Host-Interaktion dar.
Referent/in: Daniel Kampik (Würzburg)
Purpose: Retinal pigment epithelium, though naturally growth-arrested, can be stimulated to proliferate under certain conditions. We previously showed that transfection or transduction of E2F2, a cell cycle-regulating transcription factor, promotes proliferation in vitro and increases cell density in vivo. To use this concept for RPE regeneration, monolayer integrity, barrier function and the possibility of epithelial-mesenchymal transition (EMT) have to be addressed. Methods: ARPE19 cells were grown to confluent polar monolayers on 0.4 µm Transwell filters. Growth-arrest was achieved by contact inhibition and serum starvation for 2 weeks. Cells were then transfected using polyethylenimine (1 µg DNA + 2µg PEI). Cell cycle regulator E2F2 or reporter gene GFP were under the control of a CMV promoter (pCMV-HA-E2F2 and pCMV-GFP, Addgene), an empty backbone vector served as control. Monolayer integrity was assessed by ZO-1 immunostaining; barrier function by FITC-dextran (4 kDa) and Na-Fluorescein permeability, quantified by spectrophotometry; and EMT assessed by immunostaining, Western blot, and qRT-PCR for α-smooth muscle actin, N-cadherin, collagen IV and fibronectin. Results: Transfection rate for pCMV-HA-E2F2 was 10%. 7 days after transfection, this resulted in a 3-fold increase in E2F2 protein levels compared to control plasmid, and coincided with increased protein levels of proliferation marker Cyclin D1, and increase in Ki67 positive nuclei. ZO-1 staining revealed focal areas of tight junction disruption only up to 5 days post transfection. Paracellular permeability for both FITC-dextran and fluorescein was increased during the first 5 days post transfection (20% and 24%, respectively) but then returned to base levels of untouched controls from day 7 onwards. One week after E2F2 transfection, EMT markers α-smooth muscle actin, N-cadherin, collagen IV and fibronectin retained equal levels to untouched control cells, while TGF-β2 induced cells showed a significant upregulation. Conclusions: E2F2 can induce cell proliferation in a growth-arrested RPE in vitro model. In contrast to proliferation seen in proliferative vitreoretinopathy, transient E2F2 induced proliferation in this in vitro model does not induce EMT, and monolayer integrity and barrier function fully recover. In vivo studies are needed for further validation.
Referent/in: Yoko Miura (Lübeck)
Purpose: High glucose (HG)-induced cell metabolic changes precede cellular morphological alterations. Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD(H)) is one of the most important coenzymes which function as an electron carrier in cellular respiration, and plays a significant role in cell metabolisms. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) enables to measure the fluorescence lifetimes of the free- and protein bound-forms of the NADH, and thus enables to monitor intracellular NADH status. In this study, we investigated the effect of HG-conditions on NADH fluorescence lifetimes of retinal microvascular endothelial cells using FLIM. Methods: Cultured human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC) were incubated in standard (4.5 mM) or high (30 mM) concentration of glucose over 120 hours. At the indicated time points, FLIM combined with two-photon microscopy (TPM; Mai-Tai Ti:sapphire laser, λex=730 nm) was conducted. Intracellular reactive oxygen species (ROS) was estimated with 2‘,7’- dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA)-assay, and intracellular protein expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) was detected with western blotting. Results: Intracellular ROS and VCAM-1 protein expression in HRMEC were significantly increased after 60 hours under HG-conditions (30 mM), where ROS increased up to 130% (p< 0.05) and VCAM-1 250% (p< 0.05) compared to the non-treated control. On the other hand, in the cells after longer incubation (120 hours) intracellular ROS and VCAM-1 were found almost the same level as control (ROS:110% (p=0.2), VCAM-1:108% (p=0.18)). In FLIM, the ratio of the amplitude of shorter and longer lifetime component (a1/a2), indicating the ratio of the amount of free- to protein-bound NADH, significantly decreased in both mitochondrial and nuclear regions after 60 hours (whole cells: 7.64 to 6.84, mitochondria: 4.37 to 3.94, nucleus: 12.08 to 8.09), whereas they were almost equivalent to the control level after 120 hours. Conclusions: Although the mechanisms of the metabolic alterations of HRMEC during incubation under HG conditions are still to be elucidated, the development of intracellular ROS and VCAM-1 expression under HG conditions over time showed a similarity to the one of the ratio of the short- and long-lifetime components of NADH fluorescence. These results suggest that metabolic changes in living HRMEC under high glucose conditions may be sensitively and non-invasively monitored with TPM-FLIM.
Referent/in: Wolfram Eichler (Leipzig)
VEGF gilt als Schlüssel-Zytokin bei der Entstehung pathologischer Neovaskularisationen in der Retina. Retinale Glia- (Müller-) Zellen sind Produzenten dieses Faktors, den sie unter Ischämie bzw. Hypoxie hochregulieren. Weiterhin sezernieren Müllerzellen mehrere antiangiogene Mediatoren wie z.B. PEDF (pigment epithelium-derived factor) und TGF (transforming growth factor)-β; hierdurch wird konstitutiv eine antiproliferative Umgebung für die Gefäß-Endothelzellen festgelegt. Wenn diese antiangiogenen Faktoren neutralisiert werden, kann dies den angiostatischen Einfluß von Müllerzellen auf die endotheliale Proliferation verringern. Sowohl PEDF als auch TGF-β2 kontrollieren die Proliferation retinaler Endothel-Zellen, indem sie die intrazelluläre Signalweiterleitung durch MAP-Kinasen (ERK-1/-2) unterdrücken. Weiterhin ist der antiproliferative Einfluß von TGF-β2 mit einem Anstieg der Phosphorylierung von Smad-Proteinen assoziiert. Eine Exposition retinaler Endothelzellen gegenüber TGF-β2 oder einem Cocktail von Faktoren, die durch Müllerzellen sezerniert werden, führte zu einer erhöhten Aktivierung von Smad2/3, welche offensichtlich eine Rolle bei der Steuerung der TGF-β2-vermittelten reduzierten ERK-1/-2-Aktivität spielt. Angesichts ihres Einflusses auf endotheliale Signal-Mechanismen und die Proliferation von Endothel-Zellen besitzen Müllerzellen eine bedeutende Rolle bei der Kontrolle von Angiogenese und retinaler Neovaskularisierung.