Freie Vortragssitzungen, Donnerstag, 1.10.2015

 
Saal C 14:30 - 16:00 01.10.2015
Freie Vortragssitzung Do16
Retina: AntiVEGF-Therapie Retina: AntiVEGF-Therapy
Vorsitzende/r: Jost Hillenkamp (Würzburg), Albrecht Lommatzsch (Münster)

Referent/in: Ralf Dutescu (Aachen)
Fragestellung: Grisanti et al. zeigten einen negativen Einfluss der Qualität und Effektivität von Ranibizumab Antikörpern durch Lagerung in ausgeeinzelten Fertigspritzen gegenüber der Lagerung in der unausgeeinzelten Originalspritze (Lucentis®, Novartis). Dies wiederspricht vergleichbaren Untersuchungen mit Antikörpern und soll im Folgenden überprüft werden. Methodik: Bevacizumab wurde im Original (40ml, 25mg/ml, Avastin, Roche) bzw. in Plastikspritzen ausgeeinzelt (n=3) verwendet. An den Tagen 1, 7, 14 und 28 nach Auseinzelung wurde der PH-Wert, die Antikörper-Antigenbindung (VEGF-165) mittels ELISA, die Proteinkonzentration (Bradford reagent) und die Antikörpertertiärstruktur mittels zweiter-Ableitung UV Spektroskopie (Mikrotitrierplatten Photometer, Tecan) untersucht. Die UV-Spektroskopie bestimmt die intrinsische Fluoreszenz aromatischer Aminosäuren. Änderungen des Absorptionspeaks (nm) sind als Änderung der Tertiärstruktur von Antikörpern zu interpretieren. Ergebnis: Zwischen Original und ausgeinzelten Proben zeigen sich keine signifikanten Unterschiede der PH-Werte (6,105 ±0,035 vs 6,115 ±0.025). Die photometrisch bestimmte Antiköper-Antigen-Bindung war ebenfalls an allen Zeitpunkten vergleichbar zwischen Original (3,27 ±0.15) und ausgeeinzelten Proben (3,08 ±0,18). UV-Spektroskopisch lässt sich die Emission der aromatischen Aminosäure Phenylalanin darstellen. Dessen Emissionsmaxima zeigen keine signifikanten Unterschiede zwischen den verschiedenen Proben (Avastin original 278,5 nm ±0.87, ausgeeinzelt 278,5 nm ±0.87). Für die Proteinkonzentration zeigt sich an Tag 28 eine vergleichbare Proteinkonzentration (Avastin original 21,939 mg/ml ± 0,068, ausgeeinzelt 23,480 mg/ml ±0,085) Schlussfolgerung: Das Auseinzeln von Bevacizumab in Plastikspritzen führt zu keiner quantitativen bzw. qualitativen Änderung des enthaltenen Antikörpers über einen Zeitraum von 4 Wochen.
Referent/in: Heidrun Deissler (Ulm)
Purpose: Bevacizumab, a humanized monoclonal antibody binding to VEGF-A, is widely used off-label to treat AMD or DME. Internalization of this IgG by immortalized bovine retinal endothelial cells (iBREC) associated with unspecific inhibition of cellular migration has already been shown. Here we investigated its transport and intracellular localization more closely and whether neonatal Fc receptor (FcRn) is involved. FcRn is necessary for proper transport and recycling of IgG. Methods: Intracellular localization of bevacizumab and FcRn was assessed by western-blot analyses of fractionated extracts after uptake of the antibody. To study transport, iBREC were grown on membrane inserts placed in multi-well plates. After addition of bevacizumab to the lower chamber, aliquots of the supernatant in the upper chamber were analyzed at various time points (2 h to 3 d). Uptake and transport of bevacizumab was studied in the presence or absence of fetal calf serum (FCS). In addition, the effect of IgG-binding Protein A on bevacizumab transport or internalization was analyzed. Results: At 5% FCS, bevacizumab was transported through an iBREC monolayer as well as recycled at the basolateral surface. Transport through the monolayer was markedly inhibited in the absence of FCS. Western-blot analyses of fractionated extracts revealed that in the presence of FCS, bevacizumab was associated with proteins from the membrane/organelle and the cytoskeleton fractions 2 to 24 h after uptake. In the absence of FCS, a vast amount of bevacizumab associated with insoluble proteins or the cytoskeleton fraction. Reduction of FCS also resulted in reduced or lost expression of FcRn usually associated with proteins from the membrane/organelle fraction. In addition, transport of bevacizumab was markedly hindered by Protein A which competes with FcRn for binding to the Fc-terminus of IgG. In the presence of Protein A, bevacizumab was still detected in the fraction of cytoskeleton proteins but not in the membrane protein fraction. Conclusion: Our results show that bevacizumab is is taken up by iBREC by different pathways depending on serum conditions. FcRn is most likely part of one of these pathways and seems to be necessary for proper transport and processing of bevacizumab. Uptake of bevacizumab by REC in absence of serum might be dangerous for these cells due to potentially accumulation of the drug.
Referent/in: Nil Celik (Heidelberg)
Fragestellung: Hochauflösende Mikroskopietechniken sind auf dem Vormarsch (Nobelpreis für Chemie 2014). Wir stellen eine Weiterentwicklung vor, die eine hochauflösende Darstellung auf molekularer Ebene ermöglicht und die Interaktion von Bevacizumab mit dem retinalen Pigmentepithel erkennbar werden lässt. Methodik: Unsere Arbeitsgruppe hat ein spezielles Mikroskop entwickelt, welches die strukturierte Beleuchtung (SIM) und die Lokalisationsmikroskopie (LM) kombiniert (Anregungswellenlängen: 488nm, 568nm und 671nm). Dieses ermöglicht hochauflösende 3D-SIM Aufnahmen mit einer Auflösung von 150nm und die Lokalisation von Fluorophoren mit einer Genauigkeit von 20nm. Kultivierte transfizierte ARPE-19 Zellen (GFP für den Kern und RFP für die Membran) wurden nach Zugabe von gelabeltem Bevacizumab (6S-IDCC) untersucht. Ergebnisse: Die intrazellulare Medikamentenaufnahme und Akkumulation wurde mittels hochauflösender Mikroskopie erfasst. 3D-SIM Aufnahmen ermöglichen die qualitative Analyse der Bevacizumab-Verteilung innerhalb und außerhalb der Zellen. Die Lokalisationsmikroskopie bietet mit höheren Intensitäten die exakte Lokalisation von einzelnen Bevacizumab-Molekülen. Schlussfolgerung: Wir zeigten erstmalig die Anwendung hochauflösender Mikroskopie für lebende ARPE-19 Zellen. Die von uns vorgestellte Kombination aus SIM und LM ermöglicht die Visualisierung der Aufnahme von Medikamenten in RPE-Zellen. Einzelne Medikamentenmoleküle können mit einer bis zu 10fach höheren Präzision dargestellt werden als mit dem Auflösungsvermögen konventioneller Mikroskopie.
Referent/in: Justus G. Garweg (Bern)
Background: Since the first use of intravitreal anti-VEGF drugs fears about a possible harm resulting from VEGF suppression are influencing our therapeutic decisions. In early days, fears targeted the development of capillary damage after intravitreal therapy (IVT) namely in situations with preexisting vascular impairment such as in diabetic retinopathy. With time, fears focussed on the long term side effect on the choroid, namely the development of geographic atrophy (GA) which has been associated with therapy at latest since the publication of the CATT study. Aim of the present study is therefore to present an overview on the scientific basis of macular atrophy in the context of IVT. Method: The underlying work used online search strategies to identify and evaluate prospective and controlled experimental and clinical studies targeting this topic in order to provide a cohaerent presentation of the current understanding of the contrasting informations. Results: Already ten years ago, impairment of choriocapillaris, RPE and neuroretina resulting from VEGF depletion were demonstrated experimentally. Translated into clinical strategies, this resulted in the advoaction of the „pro re nata” strategy, to reduce the number of injections to the minimal clinical needs. Follow up studies of patients under this strategy have, however, demonstrated that not only the long term outcomes are less satisfying than expected, but also atrophic changes develop more readily than expected with a relevant, though not functionally precipitating increase in GA. Based thereon, the currently advocated “treat and extend strategy” has been developed in the hope to improve long term outcomes. Conclusion: After more than a decade of experience with anti-VEGF drugs we have learned that there is a potential treatment-associated damage, which is by far outweighed by the functional gain. Nevertheless, increasing evidence argues against a concept of permanent VEGF suppression and in favour of a combination therapy to ameliorate the encountered treatment side effects. These are, however, possibly more linked to the natural progression of disease and the biological grounds of affected individuals since they differ from those in patients with other retinal diseases under the same therapy, namely in diabetes and retinal vein occlusion.
Referent/in: Viktoriya Chugina (Karlsruhe)
Fragestellung: 2012 wurde Aflibercept zur Behandlung der feuchten AMD zugelassen. Aflibercept weist eine höhere Bindungsaffinität zu VEGF auf als native VEGF-Rezeptoren und im Unterschied zu anderen anti-VEGF-Inhibitoren bindet es auch PIGF. Das Ziel unserer Studie ist es zu prüfen, ob Non-Responder oder Patienten mit persistierender chorioidaler Neovaskularisation trotz repetitiver intravitrealer Injektionen mit Ranibizumab eine Besserung mit Aflibercept im Sinne von morphologischen und/oder funktionellen Ergebnissen aufweisen können. Methodik: Es handelt sich um eine eine retrospektive Beobachtungsstudie mit 32 Augen (30 Patienten), die bei persistierender subretinaler und/oderintraretinaler Flüssigkeit von Ranibizumab auf Aflibercept umgestellt wurden. Die Patienten erhielten mindestens 1 Ranibizumab-Injektion und mindestens 1 Aflibercept-Injektion . OCT-Kontrollen wurden auf folgende Parameter untersucht: zentrale Makuladicke, subretinale Flüssigkeit, Pigmentepithelabhebung, intraretinale Zysten. Diese wurde mit dem Befund der Fluoreszenzangiographie abgeglichen. Die Korrelation zwischen morphologischen Ergebnissen und der Visusveränderung wurde analysiert. Ergebnis: Die Patienten erhielten 1 bis 15 Aflibercept-Injektionen. Morphologische Veränderungen im Sinne einer Verminderung der Makuladicke zeigte sich bei den meisten Patienten schon nach einer Aflibercept-Injektion, außerdem wurde in ca. 25% der Fälle schon nach einer Aflibercept-Injektion ein trockener Netzhautbefund festgestellt. Die Sehschärfenveränderung war vom Stadium der Erkrankung und der Ausgangssehschärfe abhängig. Schlussfolgerung: Durch den Wechsel von Ranibizumab auf Aflibercept kann eine morphologische und funktionelle Besserung bei chronisch persistierender exsudativer AMD erzielt werden.
Referent/in: Christina Nicolaeva Vidinova (Sofia)
Purpose: Age related macular degeneration (AMD) is a disease with high social impact severely hindering the quality of life of the affected patients. The aim of our study is to reveal the ultrastructural changes in the choroidal neovascular membranes occurring after the intravitreal admission of Afibercept (Eylea). Methods: In our prospective study 12 patients with AMD were enrolled . In 7 patients Bevacizumab (Avastin) was applied and in 5 Afibercept (EYLEA) was administered intravitreally. They all underwent complete ophthalmologic examination including OCT. On a later stage, due to complications Pars plana vitrectomy with excision of the subretinal membranes was performed. Proliferations taken directly from the eye have been studied transmission, scanning electron microscopically and with Safranin O. Results: Subretinal membranes in AMD patients consisted mainly of fibroblasts, isolated or grouped RPE cells and elements of the blood. Numerous capillaries of subretinal blood vessels were also found. The endothelial fenestration in the Avastin treated patients was significantly reduced. Densely packed thrombocytes and erythrocytes occluded the capillary lumen. In EYLEA treated patients the endothelial fenestration reduction and thrombotic microangiopathy were more severe. Lots of macrophages were found in the membranes. The RPE cells showed significant alterations and degeneration- shrinkled plasmalema, deteriorated intercellular contacts, lack of lysosomal granules. The histochemical staining with Safranin O showed greater number of proteoglycan complexes in the extracellular matrix. Conclusion: Our results point out that both Bevacizumab and Afibercept cause changes in the new vessel walls in the subretinal membranes and in the extracellular matrix components. Afibercept however inflicts more significant reduction of endothelial fenestration and more evident thrombotic microangiopathy than other anti- VEGF drugs, which explains the very good anatomical results achieved even after one injection of the drug. Alterations and degenerative changes in the RPE cells however, observed in our study correspond to the findings of other authors showing that EYLEA impairs wound healing and phagocytosis of the RPE. This can be an important side effect of the drug in the long term experience.
Referent/in: Justus G. Garweg (Bern)
Background: Many case series in recent years have reported anatomical, but not functional improvement in eyes after switch from Ranibizumab to Aflibercept in case of unsatisfying treatment response (non-responders) over a follow up of 6-12 months. Therefore, we were interested to compare the outcomes of Aflibercept treatment in treatment-naïve and Ranibizumab-pretreated eyes switched to Aflibercept for unresponsiveness and for other reasons after a follow up of 18 to 24 months. Patients and Methods: All eyes having received intravitreal Aflibercept injections according to „treat and extend“ criteria within a follow up of ≥18 months were included in the underlying retrospective case series and attributed to one of three groups: treatment-naïve eyes (group 1, n=38), eyes that had been switched from pretreatment with ranibizumab in the absence of evidence for treatment resistance (group 2, n=94), and eyes after switching from Ranibizumab to Aflibercept due to unsatisfactory therapeutic response („non-responders“, as defined by persisting intra- or subretinal fluid or the need of maintenance injection intervals of ≤6 weeks; group 3, n=33). Results: After an average follow up of 21.7±4.5 months, treatment-naïve and pretreated eyes without evident treatment resistence differed from “non-responders” regarding the number of injections required over 12 and 24 months (5.9±2.2; 5.1±1.9 and 6.2±2.3 injections within 12 months (p=0.019) and 8.4±3.8; 8.8±3.8 vs. 10.7±4.8 injections over 24 months (p=0.042)). The retreatment interval, in contrast, did not differe between groups 2 and 3 (11.9±5.4 vs. 9.3±4.3 weeks; p>0.05). After a mean visual gain of 5, 1, and 3 letters in groups 1-3 in the loading phase (p>0.05) best-corrected visual acuity remained stable in all 3 groups during follow up with (logMAR) 0.48±0.44; 0.45±0.37; 0.52±0.32 for groups 1-3, respectively (p>0.05). Treatment-relevant fluid in the OCT was present in 57.9%, 59.6% und 69.7% at the end of follow up (p>0.05). Conclusion: Visual acuity achieved after a loading phase remained stable over the follow up of 24 months in all three groups, including Ranibizumab „non-responders“. Nevertheless, non-responders tended to present more frequently persisting fluid at the end of follow up and shorter injection intervals. This may indicate that Ranibizumab “non-responders tend to also respond less well to intravitreal Aflibercept compared to other groups of eyes.
Referent/in: Heinrich Gerding (Olten)
Purpose: To analyze the long-term outcome of PRN anti-VEGF treatment in patients with wet AMD. Methods: A retrospective analysis of an institutional case series (104 patients, 104 eyes, mean age ± SD: 77.6 ± 7.3 years) was performed. All patients were examined monthly during year 1 and further on according to an individualized PRN regimen. Re-treatment was allowed for any signs of disease activity. In all cases basic treatment consisted of ranibizumab, starting with a loading of 3 injections. In 17 eyes treatment was switched to aflibercept in year 6 or 7. Results: 53 of 104 patients (51 %) continued treatment or observation until the end of year 7. Visual acuity improved by +1.4 +/- 0.3 (mean ± SE) lines during the loading phase and was +1.0 +/- 0.3 lines at month 12, +0.1 +/- 0.4 at month 48, and -0.9 +/- 0.7 lines at month 84. 27 of the 53 patients (51%) finishing year 7 presented disease activity and received anti-VEGF injections within the last year of observation. The mean number of intravitreal injections in those patients completing the final examination was 23.5 +/- 16.2. 86 % of these eyes presented subretinal dense material (mainly fibrotic tissue), and 66 % geographic atrophy at the final 7 years examination. Conclusions: The results of this case series demonstrate that flexible intravitreal anti-VEGF injections can result in a long-term stabilization of visual function well above the level of the natural course of the disease.
Referent/in: Dominika Podkowinski (Wien)
Intraretinale zystoide Flüssigkeit (IRC) ist mit einem Verlust von Sehschärfe bei neovaskulärer altersbedingter Makuladegeneration (nAMD) vergesellschaftet. Andererseits suggerieren neueste Ergebnisse, dass subretinale Flüssigkeit (SRF) mit einer günstigeren Visusprognose assoziiert sein könnte. Jedoch stützen sich alle bisherigen Studien auf eine qualitative Bewertung, ob Flüssigkeit vorhanden ist oder nicht. Dies verhindert eine quantitative funktionelle Vorhersage. Das Ziel dieser Studie war es, quantitative Messungen von IRC und SRF mit der Visusfunktion bei antiangiogenetischer Therapie der nAMD zu korrelieren. Es wurden 38 Patienten mit unbehandelter subfovealer choroidaler Neovaskularisation bei AMD, die monatlich über 12 Monate mit Ranibizumab oder Aflibercept behandelt wurden, eingeschlossen. IRC und SRF wurden manuell auf jedem B-scan von spectral-domain OCT Volumenscans zu den Zeitpunkten Baseline, Monat 1, 6 und 12 annotiert. Eine automatisierte systematische Suche nach jenen annotationsbasierten Variablen, die die beste Voraussage für den Visus liefern könnten, wurde durchgeführt. Es wurde ein exponentielles Model für die Visusveränderung unter Therapie erstellt und Korrelationen zwischen IRC, SRF und Ausgangsvisus, Visus bei Monat 12, sowie die Veränderung des Visus berechnet. IRC und SRF wurden in 19.456 B-scans quantifiziert. Zum Zeitpunkt Baseline zeigte die abgedeckte Fläche an zentral gelegenen IRC die beste Korrelation mit dem Visus (R²=0.59, p< 0.0001). Derselbe Indikator zu Baseline konnte auch den Visus bei 12 Monaten vorhersagen (R²=0.21, p=0.0034). Die Veränderung von Sehschärfe von Baseline zu Monat 12 zeigte sowohl in dem exponentiellen Model (R²=0.40, p< 0.0001), als auch in dem linearen Model (R²=0.25, p=0.0015) eine signifikante Korrelation mit der Abnahme der von IRC abgedeckten Fläche. Im Gegensatz dazu gab es keine signifikante Korrelation von SRF, dem Visus zum Zeitpunkt Baseline oder dem Visus an einem späteren Zeitpunkt. Von IRC abgeleitete morphologische Variablen können für präzise Vorhersagen sowohl des Visus zu Baseline, als auch der Visusveränderung unter Therapie herangezogen werden. Während eine Abnahme von IRC statistisch signifikant mit der Visuszunahme korreliert, scheint ein Teil des durch IRC bedingten neurosensorischen Schadens irreversibel zu sein. IRC als Biomarker ermöglichen eine personalisierte Visusprognose, basierend auf retinaler Pathomorphologie und könnten in klinischen Studien als Endpunkt fungieren.